Nghiên cứu áp dụng phương pháp trắc định xê lệch ngưng kết gián tiếp chuẩn để phát hiện mầm bệnh dại ở động vật

Xác định nước bọt chó có mamg virus dại hay không là việc quan trọng vì giúp xác định hiệu quả của công tác phòng chống bệnh dại cũng như sự cần thiết phải tiêm kháng huyết thanh chống dại sau khi bị chó cắn. Phát hiện virus dại ở động vật còn giúp xác định nguồn gốc xâm nhập của virus vào đàn gia súc và người. Tuy thế giới đã có một số phương pháp xét nghiệm chẩn đoán bệnh dại, nhưng do nhiều lý do về kỹ thuật cũng như kinh tế nên chưa phổ biến vào thực tiễn nước ta mặc dù bệnh dại vẫn tiếp tục gây chết người (gần 100 người mỗi năm trong cả nước ta) mà nguyên nhân phổ biến là do chó cắn.

Trên cơ sở những kết quả nghiên cứu tìm kiếm phương pháp chẩn đoán phát hiện kháng nguyên virus cúm và dịch tả lợn chúng tôi đã tạo ra phương pháp SSIA và lần nay mở rộng áp dụng phương pháp này cho việc phát hiện virus dại trong nước bọt chó. SSIA là phương pháp thực hiện trên khay vi chuẩn độ 96 lỗ (giếng), cần các nguyên liệu là hồng cầu ngan gắn một virus (kháng nguyên IHA) và kháng huyết thanh chống virus tương ứng có hiệu giá 4log2 với kháng nguyên IHA 1%, bên cạnh mẫu dịch nước bọt cần xét nghiệm.

Để lấy nước bọt, dùng panh sạch kẹp một nhúm bông đã được vô trùng đưa vào miệng chó khoảng 5 phút, lấy ra khi bông đã ngấm ướt, đưa vào ống Eppendorf, bảo quản ở tủ lạnh sâu -20 oC.

Phản ứng IHA được tiến hành trên khay nhựa vi chuẩn độ 96 lỗ đáy chữ U (Phạm Hồng Sơn, 2004) nhằm xác định hiệu giá kháng thể đặc hiệu virus dại trong huyết thanh động vật, mỗi dãy 12 lỗ khay được sử dụng cho một phản ứng (8 phản ứng trên mỗi khay vi chuẩn độ). Phản ứng có thể thực hiện với một pipet tự động được điều chỉnh thể tích 25µl đến 50µl. Dưới đây mô tả với thể tích 25µl. Đầu tiên cho vào tất cả các lỗ 25 µl dung dịch sinh lý NaCl (pH 7,2), sau đó cho vào lỗ thứ nhất 25 µl huyết thanh cần kiểm. Trộn đều bằng cách hút nhả 5 - 6 lần rồi hút qua lỗ thứ hai, thứ ba và tiếp tục các thao tác cho đến lỗ thứ 10 thì hút bỏ 25 µl. Thêm vào tất cả các lỗ 25 µl hồng cầu gắn kháng nguyên 1%. Đậy kín khay bằng một khay khác  để tránh bị khô, để ở nhiệt độ phòng đến khoảng 3 giờ. Lỗ thứ 11 của mỗi dãy lỗ khay được làm lỗ đối chứng âm còn lỗ 12 đối chứng dương. Đối chứng âm gồm dung dịch sinh lý (pH 7,2) và kháng nguyên IHA dại 1%. Đối chứng dương gồm kháng huyết thanh chuẩn, kháng nguyên IHA dại 1%. Đọc kết quả dựa vào lỗ đối chứng (đối chứng âm và dương) ở các lỗ thứ 11, 12. Phản ứng âm tính hồng cầu lắng xuống tâm đáy, hình thành chấm tròn. Phản ứng dương tính có hiện tượng ngưng kết hồng cầu, hồng cầu chìm chậm với thời gian kéo dài thường trải đều trên đáy khay, tạo thành lớp nhăn nheo, tạo thành vòng có đường kính lớn hơn 3/4 đường kính lỗ khay.

Nguyên lý phản ứng SSIA tương đối đơn giản, dựa vào tính cạnh tranh của kháng nguyên trong bệnh phẩm đối với kháng nguyên chuẩn khi phản ứng với kháng thể, tức là, kháng nguyên trong bệnh phẩm kết hợp trước với kháng thể chuẩn làm hiệu giá kháng thể chuẩn giảm khi kiểm tra bằng IHA với kháng nguyên gắn hồng cầu (kháng nguyên IHA) đã chuẩn hóa. Do virus dại bài xuất theo nước bọt (Nguyễn Vĩnh Phước và CS, 1978), nên nước bọt của chó là bệnh phẩm thích hợp, nếu trong dịch bệnh phẩm này có chứa kháng nguyên sẽ có sự xê lệch ngưng kết gián tiếp chuẩn (Phạm Hồng Sơn, 2009). Phản ứng được tiến hành trên khay nhựa vi chuẩn độ 96 lỗ, đáy chữ U. Khay được đặt nằm dọc, được 12 dãy lỗ, mỗi dãy có 8 lỗ. Trên mỗi khay có 11 mẫu cần kiểm được thực hiện kèm theo một mẫu chuẩn làm đối chứng. Ghi số thứ tự các lỗ từ 1 đến 8 trên đầu khay. Các dãy mẫu kiểm được thực hiện với các bước sau đây. Dùng pipet cho vào lỗ số 2 đến số 8 của mỗi dãy, mỗi lỗ 25 µl nước sinh lý (để trống lỗ thứ nhất). Cho vào lỗ thứ nhất của các dãy 25 µl dịch bệnh phẩm (nước bọt), mỗi lỗ đầu dãy chứa một mẫu (ghi số mẫu ở đầu mỗi dãy). Hút 25 µl kháng huyết thanh chuẩn 4log2 cho vào lỗ thứ nhất của mỗi dãy, dùng pipet trộn đều rồi hút 25 µl chuyển từ lỗ thứ nhất sang lỗ thứ hai, rồi lỗ thứ hai sang lỗ thứ ba và tiếp tục trộn chuyển đến lỗ số 8 thì hút bỏ 25 µl. Tiếp theo, cho vào tất cả các lỗ 25 µl huyền dịch 1% kháng nguyên dại IHA. Mỗi khay vi chuẩn độ 96 lỗ thực hiện 11 phản ứng với 11 mẫu nước bọt khác nhau. Đối chứng âm (phản ứng chuẩn) được thực hiện ở một dãy (thường là dãy cuối cùng) của mỗi khay, gồm các bước hoàn toàn tương tự với 11 dãy trên nhưng chỉ khác là ở lỗ thứ nhất không phải cho 25 µl dịch bệnh phẩm mà 25 µl dung sinh lý. Đậy nắp khay, để ở nhiệt độ phòng trong vòng 15 phút đến 4 giờ, kiểm tra để đọc kết quả các phản ứng khi ngưng kết hồng cầu của dãy đối chứng âm biểu hiện rõ hiệu giá kháng thể chuẩn (thường là 4log2) với kháng nguyên IHA chuẩn. Phản ứng là âm tính nếu không có sự xê lệch lỗ ngưng kết cuối cùng so với dãy đối chứng. Ngược lại, phản ứng dương tính nếu có sự xê lệch lỗ ngưng kết cuối cùng sang trái (hiệu giá kháng thể giảm xuống 3, 2, 1 hoặc 0log2) so với dãy đối chứng.

Phản ứng kiểm tra SSIA: Với hồng cầu ngan gắn vaccine virus dại và kháng huyết thanh chống dại sản xuất từ gà hoặc kháng huyết thanh ngựa chống dại ở người, nghiên cứu của chúng tôi đã trải qua các bước thử thách SSIA với các mẫu nước bọt chó bình thường trộn và không trộn thêm kháng nguyên virus dại dưới dạng vaccine cho thấy vaccine dại trộn nước bọt chó âm tính và vaccine dại trộn nước sinh lý cho kết quả phản ứng SSIA dương tính như nhau và trong khi các mẫu nước bọt chó không chứa virus đều âm tính như nhau khi pha trong dung dịch sinh lý NaCl 0,9% cũng như trong nước bọt âm tính. Điều đó cho thấy nước bọt chó hoạt động trong phản ứng SSIA tương tự dung dịch sinh lý, tức không trở ngại cho phản ứng.

Xét nghiệm bằng SSIA 1064 mẫu nước bọt chó nuôi khỏe mạnh trên địa bàn Thừa Thiên Huế (gồm thành phố Huế và huyện Hương Trà) năm 2013 và 2014 cho thấy có 44 chó trong số đó chứa kháng nguyên virus dại trong nước bọt, chiếm 4,14%, còn trong số 1919 mẫu nước bọt từ Nghệ An, Hà Tĩnh và Quảng Trị có 57 mẫu dương tính, chiếm 2,97%. Thử nghiệm bảo quản kháng nguyên IHA cho thấy sau 4 tháng nguyên liệu không ổn định về phẩm chất. Tuy nhiên, trong quá trình bảo quản đó ta có thể sử dụng kháng nguyên nguyên liệu này để xét nghiệm khảo sát miễn dịch của đàn chó do thử nghiệm cho thấy hiệu giá kháng thể 16 IHA (tức 4log2) tương đương nồng độ kháng thể 0,5mg/ml theo phương pháp xét nghiệm trung hòa virus với kháng thể huỳnh quang là mức chuẩn mà châu Âu quy định chó phải có trong huyết thanh khi quá cảnh. 

Kết quả SSIA với một số mẫu nước bọt chó thu thập tại Thừa Thiên Huế (các mẫu biểu hiện dương tính có khoanh số (10, 13 và 19): lệch trái so với dãy chuẩn (C) trên mỗi khay vi chuẩn độ.

SSIA là phương pháp có thể cho kết quả nhanh (từ 30 phút đến 1 giờ), không cần xử lý bệnh phẩm: nếu có nước bọt có thể làm phản ứng ngay nên không mất thời gian, không giảm độ nhạy do hao hụt trong quá trình xử lý, phản ứng có tính chủ động cao do nguyên liệu có sẵn, thực hiện nhiều mẫu cùng lúc (11 mẫu trên một khay vi chuẩn độ 96 lỗ), kết quả nhanh (khoảng 60 phút). Do đã thiết lập phản ứng IHA chuẩn với một cặp kháng nguyên chuẩn và kháng thể chuẩn biết trước và chỉ cần có thêm một lượng nhỏ kháng nguyên virus (từ bệnh phẩm) phản ứng sẽ thay đổi phản ứng nên SSIA có độ nhạy cao.

PGS.TS. Phạm Hồng Sơn

Khoa Chăn nuôi Thú y, Trường đại học Nông Lâm Huế

 

Người cập nhật:
Các bài viết khác:
 

Hổ trợ trực tuyến

Liên Kết Website

Lượt truy cập: 3419993
Đang trực tuyến: 44